عدم کارایی shrna اختصاصی بر علیه ژنe۱a درکاهش بیان پایدار در سلول های hek ۲۹۳

هدف: انکوپروتئین e1a در آدنوویروس تیپ 5 یک فاکتور تنظیمی است که موجب کنترل فرایند رونویسی ژن های آدنوویروس می شود. این پروتئین با تغییر در عملکرد پروتئین های مهم سلولی از جمله p21 و prb سبب ایجاد شرایط مساعد برای همانندسازی ژنوم ویروس و ترانسفورم شدن سلول های میزبان می شود. هدف از تحقیق حاضر مهار پایدار بیان ژن e1a در سلول های hek 293 با استفاده از روش rnai بوده تا آثار این مهار روی سلول های فوق بررسی شود. مواد و روش ها: ناحیه پروموتر u6 و shrna از دو پلاسمید اهدایی کنترل و پلاسمید کدکننده sirna اختصاصی علیه ژن e1a به نام های psp81-e1a و psp-81 در پلاسمید pcdna3.1 ساب کلون شد. سپس سازه های ساخته شده با روش لیپوفکشن به سلول های سرطانی hek 293 ترانسفکت و کلونی های سلول های ترانسفورم شده بر اساس مقاومت به آنتی بیوتیک نئومایسین انتخاب شدند. تغییرات حاصل از این عمل روی بیان ژن e1a با استفاده از روش rt-pcr بررسی شد. نتایج: بررسی ها نشان گر عدم تفاوت در میزان بیان ژن e1a در پی ترانسفکشن سلول ها با پلاسمیدهای مورد نظر در دو گروه مهار و کنترل بود. برای بررسی احتمال تأثیر روند کلونینگ بر عملکرد پروموترu6 ، سلول ها با پلاسمیدهای اهدایی نیز ترانسفکت شدند که مجدداً عدم مهار بیان ژن e1a مشاهده شد. نتیجه گیری: نتایج نشان دادند که با وجود تکرار آزمایش هکرمهار قابل توجهی صورت نگرفت. برای کسب اطمینان از صحت توالی ژن e1a، قطعه تکثیر شده در فرایندpcr ، که شامل ناحیه s13 این ژن است، توالی یابی شد. نتایج حاصل از توالی یابی با وجود جهش در یک نوکلئوتید در ناحیه ای بود که به عنوان هدف برای sirna انتخاب شده بود. بنابراین می توان علت عدم مهار را به وجود این جهش در ترادف ژن e1a در سلول های استفاده شده در این مطالعه مربوط دانست.